荧光定量数据分析-{下拉词

大家好，今天小编关注到一个比较有意思的话题，就是关于荧光定量数据分析的问题，于是小编就整理了3个相关介绍荧光定量数据分析的解答，让我们一起看看吧。

1. 荧光定量PCR技术有哪些优点呢？
2. 求助Real-Time PCR的详细步骤及注意事项？
3. 请教荧光定量PCR用的Taq酶和普通PCR的Taq酶有区别吗？

荧光定量PCR技术有哪些优点呢？

荧光定量PCR与普通PCR相比具有以下优点：

1、高灵敏性 可检测单个细胞基因；

2、高特异性和精确性 将DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精准性融合，应用荧光探针和光电传导，直接探测基因扩增过程中荧光信号的变化，以获得定量结果，相当于在PCR反应过程中自动完成了Northern杂交；

3、操作简便、速度快 通过计算机和分析软件实现PCR扩增、产物检测和定量分析一体化；

4、安全、无污染 FQ-PCR在全封闭状态下进行PCR扩增和产物分析，杜绝了传统PCR开放检测对环境的污染和由此导致的***阳性；

5、结果观测重复性好 一起在线实时观测，结果判断直观，避免人为因素干扰。

求助Real-Time PCR的详细步骤及注意事项？

实时荧光定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差，提高实验的重复性。该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果。主要实验步骤如下：

1.设计并合成RealtimePCR引物。

2.引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG（SYBR®Green）的PCR反应的优化。

3.样品RNA抽提a．实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。b．实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。

4.RNA质量检测a．紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以计算其浓度并评估RNA纯度。b．使用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。

5.使用逆转录酶（Promega）进行反应，将样品RNA逆转录为cDNA。

6.制备标准曲线样品：进行相对定量，需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线7.标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTimePCR反应液中（其中TaqBeadTM热启动聚合酶来自Promega公司），进行RealTimePCR扩增和检测8.检测结果进行标准曲线分析，以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所得结果代表某样品的目的基因相对含量。

请教荧光定量PCR用的Taq酶和普通PCR的Taq酶有区别吗？

1.首先要确定你的taq酶基因，表达的taq酶有没有5`---3`端的外切酶活性；

2.其次用于定量PCR的taq本身纯度要求非常高，降低定量PCR的干扰；

3.taq酶体系的优化影响也非常大，主要体现在buffer中成分

荧光PCR对Taq的要求与普通的对比没那么大的差别，普通能扩的很好，拿到荧光PCR再差也不会什么都没有，关键是看你的染料是不是加多了，SYBR里面的DMSO是会抑制反应的，一定注意好的用量

到此，以上就是小编对于荧光定量数据分析的问题就介绍到这了，希望介绍关于荧光定量数据分析的3点解答对大家有用。